Caracterização do metabolismo lipídico do inositol no intestino

Nature Microbiology volume 7, páginas 986–1000 (2022)Cite este artigo

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Os lipídios de inositol são onipresentes em eucariotos e têm papéis bem ajustados na sinalização celular e na homeostase da membrana. Nas bactérias, entretanto, a produção lipídica de inositol é relativamente rara. Recentemente, foi relatado que a proeminente bactéria intestinal humana Bacteroides thetaiotaomicron (BT) produz lipídios e esfingolipídeos de inositol, mas as vias permanecem ambíguas e sua prevalência não é clara. Aqui, utilizando abordagens genômicas e bioquímicas, investigamos o agrupamento de genes para a síntese lipídica de inositol em BT usando uma cepa anteriormente não descrita com controle indutível da síntese de esfingolipídios. Caracterizamos a via biossintética da síntese de mio-inositol-fosfato (MIP) até fosfoinositol dihidroceramida, determinamos a estrutura cristalina da enzima BT MIP sintase recombinante e identificamos a fosfatase responsável pela conversão de fosfatidilinositol fosfato derivado de bactérias (PIP-DAG) em fosfatidilinositol (PI-DAG). In vitro, a perda da produção lipídica do inositol alterou a expressão da cápsula BT e a resistência ao peptídeo antimicrobiano. In vivo, a perda de lipídios de inositol diminuiu a aptidão bacteriana em um modelo de camundongo gnotobiótico. Identificamos uma segunda via suposta, anteriormente não descrita, para a síntese bacteriana de PI-DAG sem um intermediário PIP-DAG, comum em Prevotella. Nossos resultados indicam que a produção de esfingolípidos de inositol é generalizada em Bacteroidetes associados ao hospedeiro e tem implicações para a simbiose.

O inositol, um açúcar carbocíclico abundante em eucariotos, forma a base para diversos fosfatos de inositol mensageiros secundários fosforilados e lipídios de inositol. Na sua forma mais simples, os lípidos de inositol têm inositol como grupo de cabeça polar, por exemplo, fosfatidilinositol (PI-DAG; estrutura glicerofosfolipídica; Fig. 1a) ou inositol fosforilceramida (estrutura esfingolipídica). O grupo principal do inositol pode ser ainda modificado, incluindo a fosforilação do PI-DAG para formar fosfoinositídeos bioativos ou a adição de uma manose aos esfingolipídios do inositol para formar as fosforilceramidas de manosilinositol abundantes na levedura . Os derivados de inositol controlam processos-chave da fisiologia das células eucarióticas. Por exemplo, embora os fosfoinositídeos constituam uma pequena fração do total de fosfolipídios, eles são essenciais para marcar a identidade das organelas, regular as interações citoesqueleto-membrana e controlar a divisão celular e a autofagia .

a, A via metabólica de síntese de esfingolipídios de novo em relação à síntese lipídica do inositol, com enzimas BT investigadas neste estudo (negrito em preto) e estruturas lipídicas representativas, com comprimento de cadeia e ramificação refletindo estruturas predominantes determinadas pela análise de éster metílico de ácidos graxos (ver Suplemento Informações, Figuras Complementares 1 e 2 e Tabela 6). Padrões de ramificação de lipídios à base de diidroceramida são previstos e não confirmados. As estruturas esfingolipídicas são nomeadas em roxo e mostradas em um fundo azul claro; as estruturas glicerofosfolipídicas são nomeadas em verde sobre fundo cinza. Os lípidos de inositol estão delineados com uma caixa de linha tracejada. SPT, serina palmitoiltransferase. b, A região genômica do inositol BT e da síntese lipídica de inositol, com numeração cromossômica (mostrada na orientação reversa). A cor do gene (azul ou vermelho) indica participação em um operon previsto pelo BioCyc. As anotações são das funções enzimáticas elucidadas neste estudo (devido à falta de um fenótipo lipídico em sua cepa knockout, BT_1524 permanece hipotético). Substratos e produtos para a porção esfingolipídica de a não estão listados, pois essas reações (além do SPT) não foram caracterizadas em Bacteroidetes.

Apesar da ampla distribuição de lipídios de inositol em eucariotos, pouco se sabe sobre a estrutura e distribuição de lipídios de inositol em bactérias. Os lipídios de inositol bacteriano são comparativamente raros e anteriormente considerados limitados em grande parte à síntese de PI-DAG em Actinobactérias (por exemplo, Mycobacteria, Corynebacteria e Streptomyces)5,6,7 e Spirochaetes (Treponema)8. No Mycobacterium tuberculosis, um patógeno intracelular obrigatório, os grupos de cabeça de inositol do PI-DAG ligam os fatores de virulência dos oligossacarídeos de superfície à membrana externa9.

1.5 and exclude those with maximum absolute log2-fold-change difference in expression <1.5 in all pairwise comparisons of conditions. The tree above the expression data represents the Euclidean column clustering defining the sample order by expression similarity. Colour in the far right column indicates gene assignment to one of 8 CPS loci. Strains tested include WT BT, iSPT, ΔBT_1522 and iSPTΔBT_1526 in the iSPT background. SPT induction in the iSPT strains at 0, 0.2, 1.0, 5.0 or 100 ng ml−1 aTC induction is indicated in shades of grey. Labels below each column indicate strain, induction level and replicate ID according to the following pattern: ‘(strain) - (aTC induction in ng ml−1) (replicate A/B)’. Blue and pink shading emphasizes replicates from the ΔBT_1526 and ΔBT_1522 strains, respectively. b, Percent abundance of inositol among total glycosyl residues detected in each WT and inositol lipid knockout strain (n = 3 biological replicates per strain tested; means ± s.d.). Legend and data colours are the same as in c and d. Full capsule analysis (lipids and glycosyl residues) are available in Extended Data Fig. 6. c, IC50 (n = 2 biological replicates per strain) for each WT and BT inositol lipid knockout strain in minimal medium supplemented with the cationic antimicrobial peptide LL-37. Data are representative of two experiments and represented as mean ± s.d. One-way ANOVA F(5,6) = 35.5; P = 0.0002; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. WT vs ΔBT_1523 P = 0.0124; WT vs ΔBT_1525 P = 0.0007; WT vs ΔBT_1526 P = 0.0016. d, Caecal BT colonization of mice after 14 d bacterial association. Copies of BT (c.f.u.-equivalents quantified by qPCR analysis of BT_1521 copy number) present in mouse caecal contents after 14 d strain association. One-way ANOVA F(3,28) = 5.6; P = 0.004; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicate measurements). WT vs ΔBT_1526 P = 0.0496; ΔBT_1522 vs ΔBT_1523 P = 0.0480; ΔBT_1523 vs ΔBT_1526 P = 0.0050. Normality of data distribution was confirmed using the D’Agostino-Pearson test at alpha = 0.05. e, Percent abundances of WT in the combined WT + ΔBT_1523 population in the initial inoculum (n = 1, mean of 3 technical replicates) and in the caeca of 8 gnotobiotic mice following a 14 d colonization (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicates per mouse). The black line indicates the median of the WT BT abundance in mouse caeca following the competition experiment (73.0%)./p>100 glycosyl residues can be bound to a single lipid-linked inositol44,45. However, the low inositol abundance in our capsule analysis lacks enough statistical power to determine this unequivocally in BT. The CPS loci expressed by BT, and differentially expressed when MIPS is deficient, have been shown to influence recognition by the host adaptive immune system and bacteriophage29,46. The strong effect of MIPS deficiency on transcription of capsule-related genes may therefore indicate an indirect role for inositol on cross-kingdom interactions./p>20 mg l−1 of E. coli culture./p>1.5./p> 0.05. In the RNA-seq experiment, P values were calculated from empirical Bayes moderated t-statistics and adjusted according to the Benjamini-Hochberg method; only significantly differentially expressed genes with >1.5 absolute log2 fold change are reported. The ‘n’ reported in each experiment represents an individual biological replicate for the relevant experiment (for example, mouse caecal sample, bacterial culture). No statistical methods were used to pre-determine sample sizes, but our sample sizes are similar to those reported in previous publications51. Data collection and analysis were not performed blind to the conditions of the experiments. No animals or data were excluded from the analyses. In mouse experiments, mice were randomly assigned to a treatment condition to randomize age and litter of origin. For in vitro experiments, following strain generation, identical treatments were performed (for example, lipid extraction and analysis, capsule extraction and analysis, AMP resistance and growth curves) so randomized allocation was not necessary. TLC experiments were repeated independently at least two times with similar results./p>