A estrutura cristalina da pneumolisina com resolução de 2,0 Å revela o empacotamento molecular do pré

Scientific Reports volume 5, Artigo número: 13293 (2015) Citar este artigo

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A pneumolisina é uma citolisina dependente de colesterol (CDC) e fator de virulência do Streptococcus pneumoniae. Ele mata as células formando poros montados a partir de anéis oligoméricos em membranas contendo colesterol. Cryo-EM revelou as estruturas dos oligômeros de pré-poros e poros inseridos ligados à superfície da membrana, no entanto, os contatos moleculares que medeiam esses oligômeros são desconhecidos porque informações de alta resolução não estão disponíveis. Aqui determinamos a estrutura cristalina da pneumolisina de comprimento total com resolução de 1,98 Å. Na estrutura, os contatos cristalinos demonstram as prováveis ​​interações que permitem a polimerização na membrana celular e o empacotamento molecular do complexo pré-poro. A atividade hemolítica é anulada em mutantes que rompem esses contatos intermoleculares, destacando sua importância durante a formação de poros. Uma estrutura cristalina adicional do domínio de ligação à membrana sugere que alterações na conformação de uma alça rica em triptofano na base da toxina promovem interações monômero-monômero na ligação à membrana, criando novos contatos. Notavelmente, os resíduos na interface são conservados em outros membros da família CDC, sugerindo um mecanismo comum para a montagem de poros e pré-poros.

A citolisina dependente de colesterol (CDC), a pneumolisina1, é um fator de virulência do patógeno humano Streptococcus pneumoniae (pneumococcus)2, a principal causa de pneumonia bacteriana e um importante agente de meningite e septicemia, bem como de doenças debilitantes, como otite média, séptica artrite, ceratite e sinusite3. É encontrada em praticamente todos os isolados pneumocócicos e desempenha papéis importantes na colonização, invasão e inflamação bacteriana4,5,6. Uma característica central da toxina é a formação de poros transmembranares em membranas contendo colesterol7, que lisam ou perturbam o funcionamento celular, dependendo da concentração8,9,10. A pneumolisina e outros CDCs ligam-se às membranas dos mamíferos através de uma alça rica em triptofano e um par treonina-leucina dentro de um domínio de ligação à membrana na base da toxina11,12. Foi proposto que a alça rica em triptofano surge do corpo da toxina em associação com a membrana . Todos os três triptofanos estão implicados na ligação à membrana, mas o Trp433 e o Trp435 são particularmente importantes . Uma vez ligados à membrana, os monômeros oligomerizam para formar um complexo pré-poro que subsequentemente sofre um conjunto complexo de transições estruturais para formar um poro transmembranar, normalmente compreendendo 30-50 subunidades. As estruturas dos oligômeros de pré-poros e de poros inseridos foram determinadas por crio-EM a ~28 Å e essas estruturas, juntamente com análises recentes do CDC relacionado, suilysin, mostram que a formação de poros segue o colapso vertical do pré-poro estrutura com dois grampos beta estendidos penetrando na membrana para formar o grande poro do barril beta7,15.

Embora estruturas de raios X de alta resolução tenham sido determinadas para vários CDCs, a pneumolisina provou ser evasiva. Consequentemente, a análise estrutura-função baseou-se em modelos baseados nas estruturas das outras toxinas do CDC. Criticamente, a falta de dados de alta resolução significa que as interações que permitem que os monômeros de pneumolisina se aglomerem para formar os complexos de poros e pré-poros não são conhecidas. Neste trabalho, determinamos a estrutura da pneumolisina com resolução de 1,98 Å. O arranjo de empacotamento lado a lado no cristal demonstra o empacotamento de monômeros no complexo pré-poro. Dados estruturais e de mutagénese adicionais identificaram resíduos que provavelmente contribuem para a oligomerização durante a formação de pré-poros.

A pneumolisina completa e uma forma truncada compreendendo o domínio de ligação à membrana (domínio 4) foram produzidas por expressão em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade e filtração em gel. Os cristais da toxina completa foram cultivados a 4°C e a pH 8,5. Os melhores cristais foram obtidos a partir de proteínas contendo substituições Asp385Asn e Cys432Ala. Nenhuma das mutações impede a formação de poros16,17. A unidade assimétrica continha uma única molécula com a estrutura característica de quatro domínios de um CDC, com três domínios não contíguos (domínios 1–3) ligados ao domínio de ligação à membrana C-terminal (Fig. 1A) através do domínio semelhante a uma cinta 2. Os cristais do domínio de ligação à membrana foram cultivados à temperatura ambiente e continham duas moléculas na unidade assimétrica. Ambos os modelos refinados apresentam boa estereoquímica (Tabela 1) com 95% e 93% de resíduos nas regiões favorecidas de Ramachandran.