Insights moleculares sobre a biogênese de proteínas âncoras de glicosilfosfatidilinositol

Nature Communications volume 13, número do artigo: 2617 (2022) Citar este artigo

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As células eucarióticas são revestidas com uma abundância de proteínas âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI-APs) que desempenham papéis cruciais na fertilização, neurogênese e imunidade. A remoção de um peptídeo sinal hidrofóbico e a ligação covalente de GPI no novo terminal carboxila são catalisadas por um complexo GPI transamidase da membrana do retículo endoplasmático (GPI-T) conservado entre todos os eucariotos. Aqui, relatamos a estrutura da microscopia crioeletrônica (crio-EM) do GPI-T humano em uma resolução global de 2,53-Å, revelando uma montagem heteropentamérica equimolar. A mutagênese baseada na estrutura sugere um mecanismo semelhante ao da legumaína para o reconhecimento e clivagem de substratos pró-proteicos, e um GPI endógeno na estrutura define uma cavidade composta para o substrato lipídico. Este sítio ativo alongado, originando-se da membrana e abrangendo um espaço adicional de ~ 22-Å em direção à díade catalítica, é estruturalmente adequado para ambos os substratos que apresentam um padrão anfipático que corresponde a esta geometria. Nosso trabalho apresenta um passo importante para a compreensão mecanicista da biossíntese de GPI-AP.

A ancoragem de GPI representa uma modificação pós-tradução onipresente e metabolicamente cara das proteínas da superfície celular eucariótica . Estruturalmente elucidados na década de 19806, os lipídios GPI são bioativos7 e quimicamente diversos com uma estrutura mínima que consiste em um grupo fosfatidilinositol ligado a um núcleo polissacarídeo α-Man3-(1 → 2)-α-Man2-(1 → 6)-α-Man1 - (1 → 4) -α-GlcN (Man1/2/3, as três manoses; GlcN, glucosamina; números entre parênteses indicam numeração de carbono) (Fig. 1a, Fig. Complementar 1a). O núcleo de glicano no GPI maduro carrega grupos funcionais adicionais, alguns dos quais são específicos de espécies e tecidos. O processo de maturação envolve múltiplas enzimas, incluindo manosil transferases e fosforiletanolamina (EtNP) transferases (Fig. Complementar 1b) . O EtNP em C2 de Man1 é um pré-requisito para a adição enzimática de Man38,9, após a qual a etapa dois EtNPs são transferidos sequencialmente para C6 de Man3 (como ligante para ancoragem de GPI) e Man2 (para retículo endoplasmático eficiente (ER)-Golgi transporte de alguns GPI-APs)2. A manosilação de Man3 em C2 é essencial para a ancoragem do GPI em algumas espécies como leveduras. Em algumas espécies de Trypanosoma, o C3 de Man2 e C3 / C4 de Man1 podem ter decorações sacarídicas adicionais e o C6 de GlcN é modificado com um aminoetilfosfonato (resumido na ref. 11) (Figura 1a suplementar). Em relação à parte do fosfatidilinositol, uma cadeia acila está geralmente presente em C2 do inositol antes da ancoragem do GPI (Figura 1a suplementar), mas na maioria dos casos (exceto nos eritrócitos) é removida imediatamente após a fixação do GPI . Finalmente, a cadeia gordurosa do grupo fosfatidil também sofre remodelação antes (Figura 1b suplementar) e após a etapa de ligação ao GPI, causando diversidade acila, como diacilglicerol, alquilacilglicerol ou ceramidas com comprimento e insaturação variados . .

um GPI-T substitui o peptídeo sinal C-terminal (CSP) de pró-proteínas por GPI no resíduo ω (azul) por uma reação de transaminação. Várias peças são indicadas na caixa tracejada. EtNP, fosfato de etanolamina; Cara, manose; Ino, inositol; GlcNH2, glucosamina. As preferências para os locais ω, ω+1, ω+2 e ω+3 são indicadas na caixa tracejada com aminoácidos abreviados com letras únicas. O sombreado cinza indica a membrana do retículo endoplasmático (RE). b GPI-T mostra um pico quase gaussiano na filtração em gel e todas as cinco subunidades estão presentes em um SDS-PAGE (inserção) visualizado por fluorescência em gel (esquerda) e coloração de Coomassie (direita). Vo e Vt (triângulo) indicam volume vazio e volume total, respectivamente. Os sinais de absorção de fundo antes do Vo não são mostrados completamente. G/T/S/K/U refere-se às subunidades GPAA1/PIGT/PIGS/PIGK/PIGU. A posição de cada subunidade foi determinada separadamente comparando o complexo com subunidades expressas individualmente. Um asterisco indica um contaminante menor. Os pesos moleculares dos marcadores proteicos estão indicados à direita. É mostrado um resultado representativo de três experimentos independentes. Imagens não cortadas são fornecidas em Dados de origem. c Mapa Cryo-EM (i-iii) e visão normal do domínio transmembranar do lúmen ER (iv) ou citosol (v). Os números em iv e v indicam TMHs e G/T/U/S/K referem-se a GPAA1 e PIGT/U/S/K, respectivamente. Lipídios e detergentes são mostrados como bastões (cinza). As subunidades e as densidades crio-EM associadas são codificadas por cores conforme indicado.

95% viability) at a density of 2 × 106 mL−1 were diluted 2 times and cultured at 37 °C in a 3 L flask in a CO2 incubator to re-reach 2 × 106 mL−1 (typically takes one day). Six milligrams of plasmids and 12 mg of PEI were mixed in 100 mL of medium for 20 min at RT before being added into 1 L of cell culture. Sodium valproate (Cat. P4543, Sigma) was added to a final concentration of 2 mM. Cells were harvested after 48 h by centrifugation at 1500 g for 15 min, washed once with PBS buffer, flash-frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C until use./p>